Análise por Cromatografia líquida de gel filtração

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Análise por Cromatografia Líquida de gel filtração

Turma: PGM 371

Professores: Júlio Page, Adney Luís e Thaís Rabelo

Alunos: Emanoelle Peixoto Alencar do Nascimento

Isabelle Silva do Nascimento

Lucas Marcos Cunha

Mariane Ribeiro Silva

Pedro Henrique de Souza Alves

Sarah Maria Batista Barbosa

Duque de Caxias
Agosto/2015

SUMÁRIO

1. OBJETIVOS................................................................................................................3

2. METODOLOGIA .......................................................................................................3

3. RESULTADOS E DISCUSÃO.................................................................................3

     3.1 Cromatografia em gel..........................................................................................3

     3.2 Resultados.............................................................................................................5

     3.3 Resina Sephadex..................................................................................................6

     3.4 CLGF x CLAE....................................................................................................6

     3.5 Seletividade e Sensibilidade.................................................................................7

 4. CONCLUSÃO.............................................................................................................7

5. BIBLIOGRAFIA.........................................................................................................7

1. Objetivo

Obter e visualizar a separação de dois corantes de diferentes massas moleculares (azul de dextran e vermelho de fenol) contidos na amostra, a partir da diferença do tamanho e forma das moléculas.

1. Metodologia

• Estando a coluna de resina Sephadex já empacotada e o nível de PBS (tampão fosfato salino) bem acima do início da coluna, abriu-se a torneira até que o nível do tampão ficasse muito próximo ao começo da cama (“cabeça da coluna”), sem que esta secasse.
• Fechou-se a torneira e, então, carregou-se a coluna com 100μL, utilizando uma pipeta automática (digipet), de uma mistura de 50μL de Vermelho de Fenol e 50μL de Azul de Dextran.
• A torneira foi aberta e coletou-se 4 gotas para que a mistura de corantes entrasse totalmente na coluna.
• Fechou-se a torneira. Recomeçou-se a injetar PBS com um conta-gotas e a torneira foi aberta, (mantendo o nível de PBS o mais distante possível da “cabeça da coluna” para evitar perturbações no empacotamento).
• Foram coletados sequencialmente alíquotas de 1mL, em cubetas de caminho óptico variável, até que não houvesse mais vestígio de corantes. Foram preencgidas 19 cubetas senda a 20ª o branco, contendo apenas o tampão.
• Lavou-se a coluna com tampão PBS 3 vezes.
• Todas as alíquotas foram recolhidas e lidas no espectrofotômetro (monocanal, Biospectro SP-220) em dois comprimentos de onda: λ: 620 nm (absorção máxima do corante azul) e 560 nm (absorção máxima do corante vermelho). E fez-se a leitura do Branco (somente PBS).

1. Resultados e Discussões

3.1 Cromatografia em gel

A cromatografia em gel é um método de análise de macromoléculas e de separação delas. Essa técnica também é conhecida como cromatografia por exclusão, uma vez que a coluna separação é recheada por esferas de polímeros com poros definidos. As partículas menores penetram nesses poros e os percorrem, demorando mais para serem eluídas, enquanto as moléculas maiores são excluídas e têm uma migração mais rápidas, eluindo diretamente pela coluna. Na análise feita, a substância com maior peso molecular era o Azul de Dextran (PM=2.000.000), portanto essa espécie seria a primeira espécie a ser separada. Já o Vermelho de Fenol (PM=300), ficaria mais retido na coluna devido à sua penetração e locomoção nos poros. Esse fato pode ser observado na figura a seguir:

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Figura 1: Separação dos componentes durante o processo cromatográfico

1.  Resultados

TABELA:

	λ: 620 (ABS)	λ: 560 (ABS)
1	-0,011	-0,026
2	0,008	0,008
3	-0,013	-0,013
4	-0,018	-0,017
5	0,047	0,032
6	0,026	-0,004
7	0,014	-0,019
8	0,066	0,048
9	0,044	0,037
10	0,042	0,112
11	0,029	0,207
12	0,026	0,278
13	-0,010	0,216
14	-0,018	0,118
15	0,008	0,072
16	-0,008	0,022
17	0,021	0,038
18	-0,001	0009
19	0,008	0,013
20 (Branco)	0	0

                    Tabela 1: Absorbâncias lidas de cada cubeta nos dois comprimentos de onda

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Gráfico 2: Cromatograma das absorbâncias lidas em cada fração

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