Cromatografia

Cromatografia de fase normal

   A cromatografia de fase normal foi o primeiro tipo de sistema HPLC utilizado no campo da química, e caracteriza-se por separar os compostos em base a sua polaridade. Esta técnica utiliza uma fase estacionária polar e uma fase móvel apolar, e utiliza-se quando o composto de interesse é bastante polar. O composto polar associa-se e é retido pela fase estacionária. A força de absorção aumenta à medida que aumenta a polaridade do composto e a interação entre o composto polar e a fase estacionária polar (em comparação à fase móvel) aumenta o tempo de retenção.

   A força de interação não só depende dos grupos funcionais do composto de interesse, se não também em fatores esotéricos de forma que os isómeros estruturais com frequência se pode diferenciar o um do outro. A utilização de solventes mais polares na fase móvel diminui o tempo de retenção dos compostos enquanto os solventes mais hidrofóbicos tendem a aumentar o tempo de retenção.

  A NP-HPLC caiu em desuso aos anos setenta com o desenvolvimento do HPLC de fase reversa  HPLC devido à falta de reprodutibilidade dos tempos de retenção já que os solventes paróticos mudavam o estado de hidratação da sílica ou alumínio da cromatografia.

 Cromatografia de fase reversa

   A HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste em uma fase imóvel apolar e uma fase móvel de polaridade moderada. Uma das fases estacionárias mais comuns deste tipo de cromatografia é a sílica tratada com RMe2SiCl, onde o R é uma corrente alquil tal como C18H37ou C8H17. O tempo de retenção é maior para as moléculas de natureza apolar, enquanto as moléculas de caráter polar elui mais rapidamente.

   O tempo de retenção aumenta com a adição de solvente apolar à fase móvel e diminui com a introdução de solventes mas hidrofóbicos. A cromatografia de fase reversa é tão utilizada que com frequência lhe denomina HPLC sem nenhuma especificação adicional. A cromatografia de fase reversa baseia-se no princípio das interações hidrofóbicas que resultam das forças de repulsão entre um solvente relativamente polar, um composto relativamente apolar, e uma fase estacionária apolar. A força condutora na união do composto à fase estacionária é a diminuição da área do segmento apolar do analito exposto ao solvente. Este efeito hidrofóbico está dominado pela diminuição da energia livre da entropia sócia com a minimização da interfase composto solvente polar. O efeito hidrofóbico diminui com a adição de solvente apolar à fase móvel. Isto modifica o coeficiente de partição de forma que o composto se move pela coluna e elui.

   As características do composto de interesse jogam um papel muito importante na retenção. Em general, um composto com uma corrente alquil longa associa-se com um tempo de retenção maior porque aumenta a hidrofobicidad da molécula. Ainda assim, as moléculas muito grandes podem ver reduzida a interacção entre a superfície do composto e a fase estacionária. O tempo de retenção aumenta com a área de superfície hidrofóbica que costuma ser inversamente proporcional ao tamanho do composto. Os compostos ramificados costumam eluir mais rapidamente que seus isómeros lineares já que a superfície total se vê reduzida.

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