Teste de Gram com o objetivo de caracterizar culturas bacterianas através das diferenças de parede celular

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RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS

DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA (AGC7306)

AULA 05

COLORAÇÃO DIFERENCIAL

(TESTE DE GRAM)

PROFESSORA: SONIA PURIN

 AUTORES:

Fabiana Rodrigues

Jeanderlon Veiga

Pricilla Antônia Maurício Sozo

Rafael Cavali Schlichting

Rhayana Maria Schlichting Bareta

Curitibanos

2014/2

1. INTRODUÇÃO

Como a maioria dos microrganismos aparece quase incolor quando observada através de um microscópio óptico padrão, muitas vezes devemos prepará-los para a observação. Uma das formas pelas quais isso pode ser feito é através de coloração da amostra (TORTORA, 2012).

De acordo com Silva Filho (2007), as preparações fixadas e coradas são usadas para verificar as características morfológicas dos microrganismos, sendo bastante utilizadas na identificação, pois tornam mais fácil a visualização de formas e permitem a verificação do comportamento do microrganismo em relação aos diversos corantes.

Existem dois tipos de coloração do material: simples ou diferencial. Segundo Tortora (2012), uma coloração simples é uma solução aquosa ou alcoólica de um único corante básico, e tem por objetivo destacar todo o microrganismo para que as formas celulares e as estruturas básicas fiquem visíveis. Alguns corantes simples comumente utilizados em laboratório são o azul de metileno, a carbolfucsina, o cristal violeta e a safranina.

Entre as várias técnicas de coloração diferencial, existe uma que divide os microrganismos em dois grandes grupos: Gram-positivas e Gram-negativas. Esse teste foi desenvolvido pelo bacteriologista dinamarquês Hans Christian Gram, em 1884, e é um dos mais utilizados em laboratório devido ao fato da diferenciação ocorrer de acordo com a parede celular das bactérias (TORTORA, 2012).

O preparo das lâminas para o teste de Gram é, segundo Silva Filho (2007), realizado em três etapas.

A primeira etapa consiste no preparo do esfregaço, sendo que este é feito colocando-se uma gotícula de água esterilizada juntamente com pequenas quantidades da cultura no centro de uma lâmina, tomando-se o cuidado para que estes fiquem relativamente espalhados. A segunda etapa é chamada de fixação, e é realizada passando-se a lâmina que contém o esfregaço sobre a lamparina, retirando-se o excesso de umidade. A coloração pode então ser realizada, na etapa final, e ela segue uma sequência de utilização de corantes.

 De acordo com Tortora (2012), o corante púrpura e o iodo se combinam no citoplasma de cada bactéria, corando-a de violeta escuro ou púpura. As bactérias que retêm essa cor após a tentativa de descolori-las com álcool são classificadas como Gram-positivas; as bactérias que perdem a cor violeta após a descoloração são classificadas como Gram-negativas. Como as bactérias Gram-negativas ficam incolores após a lavagem com álcool, elas não são visualizadas com facilidade. É por isso que o corante safranina é aplicado, corando as Gram-negativas de rosa, gerando assim um contraste.

Nessa aula, utilizamos o teste de Gram com o objetivo de caracterizar culturas bacterianas através das diferenças de parede celular.

1. MATERIAL E MÉTODOS

No início da aula, a professora fez a explicação da coloração das amostras em cada uma das etapas do teste, focando nas diferenças que possibilitariam a distinção entre Gram-positivas e Gram-negativas, que consiste, basicamente, na constituição da parede celular. A professora explicou que, em ambos os casos, a parede celular das bactérias permite a entrada dos corantes, deixando as células saturadas. As bactérias que possuem uma camada mais espessa de peptidoglicano, as Gram-positivas, não permitem a saída desse corante e permanecem com uma coloração violeta mesmo após a aplicação do álcool. Já as Gram-negativas, aquelas que apresentam a parede formada por uma fina camada de peptidoglicano juntamente com uma membrana externa, quando submetidas à solução de álcool-cetona, apresentam um rompimento nos lipídios que constituem a membrana externa, possibilitando a saída do corante, deixando a célula incolor. Para fins de visualização, estas podem ainda receber um corante para diferenciá-las das Gram-positivas.

Após isso, passou-se então para a preparação da lâmina que seria utilizada no teste. Primeiramente, foram desinfetadas as mãos dos membros dos grupos e a bancada de trabalho, assim como realizado em todas as aulas práticas anteriores. Na sequência, foi depositada sobre uma lâmina uma gotícula de água que recebeu o material coletado do meio de cultura com a alça de níquel-cromo, que havia sido previamente esterilizada. O material foi então misturado com a água e espalhado no centro da lâmina, com o auxílio da alça de níquel-cromo, obtendo-se assim o esfregaço.

O esfregaço foi passado, juntamente com a lâmina,  sobre a chama da lamparina, para a fixação, até que toda a água evaporasse, imobilizando os constituintes celulares. Depois que toda a água evaporou, a lâmina apresentou uma mancha branca. O processo foi realizado em duas lâminas distintas e estas podem ser visualizadas na figura 1.

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Figura 1. Lâminas após a realização do esfregaço e da fixação

Assim que as lâminas esfriaram, passaram pelas etapas de coloração.

O processo de coloração é dividido em quatro fases. Na primeira delas, a Gram I, foi aplicado sobre o esfregaço o corante cristal violeta (Figura 2a),  que penetrou no interior das células e fez com que adquirissem uma coloração púrpura. Após 3 minutos a lâmina foi lavada com água corrente e, então, foi realizada a segunda fase.

 Na Gram II, o esfregaço foi coberto com lugol (Figura 2b), uma solução iodo-iodetada, por 1 minuto. Depois de absorvida, essa substância se une com o cristal-violeta e juntas formaram um complexo no citoplasma. Passado o tempo necessário para absorção, cerca de 1 minuto, o lugol foi escorrido e a lâmina lavada, novamente, em água corrente.

Ao fim da Gram II ainda não era possível diferenciar as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, pois ambas possuíam coloração púrpura. Na Gram III, a lâmina foi lavada com uma solução de álcool e acetona, até que todo o corante que não estava retido no interior das Gram-positivas fosse removido, o que podia ser visualizado quando a solução que escorria da lâmina ficava incolor (Figura 2c). O excesso da solução foi retirado em água corrente.  

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